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木本观赏植物组织培养研究进展

作者: 组培设备 发布时间: 浏览次数0

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对木本观赏植物组织培养的研究现状进行了概述,总结了外植体类型、基本培养基种类、不同植物生长调节物质、环境条件等因素对木本观赏植物组织培养的影响,并分析讨论了组织培养过程中常见污染、褐化和玻璃化问题及其解决方法。

植物组织培养是指在无菌条件下,将离体的植物器官(根、茎、叶、花、果实、种子等)、组织(形成层、花药组织、胚乳皮层等)、细胞(体细胞和生殖细胞)以及原生质体在人工配制的培养基上培养,并给予适当的培养条件,使其长成完整植株的过程。广义的组织培养包括器官培养、组织培养、胚胎培养、细胞培养、原生质体培养、花药培养等;狭义的组织培养是指植物离体组织再生快繁技术即微型繁殖(Micro-propagation)或试管繁殖技术。

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1 木本观赏植物组织培养研究概况

植物组织培养的理论依据是植物细胞的全能性。1902年,德国植物学家Gottlieb Haberlandt提出了离体细胞培养的概念,并将分离的完全分化的细胞进行了组织培养试验。之后提出了激素控制器官形成的概念,使植物组织培养再生体系建立的研究达到了一个新水平。目前植物组织培养的应用和研究主要涉及到花卉、药用植物、农林蔬菜等方面。木本植物由于普遍存在生长周期较长,体细胞中含有较多的多酚类物质易导致植物材料褐化,短期经济效益较低,科研难度较大等现象,其组织培养研究相对较少。但经过长期探索,木本植物的组织培养技术也取得了一定成就。1934年法国学者Gautheret进行的裸子植物组织培养研究,被认为是木本植物组织培养研究的开始。

目前,杨柳科、蔷薇科、木犀科、桑科、松科、杉科、鼠李科、大戟科、紫茉莉科、棕榈科中的约近100种木本观赏植物能够实现组培快繁,并有10余种已进行大面积推广,如杉木(Cunninghamia lanceolata)、柳叶桉(Eucalyptus saligna)等。另外,约有20种针叶树的外植体诱导体细胞胚成功,如红松(Pinus koraiensis)、油松(P.tabulaeformis)及云南松(P.yunnanesis)等,在20余种阔叶树种的组织培养中观察到体细胞胚胎发生或获得再生植株,如花楸树(Sorbus pohuashanensis)已在实验室条件下完成了从未成熟和成熟合子胚中诱导出体细胞胚,并再生出体胚苗;柑橘(Citrus reticulata)胚性细胞系的建立和体细胞胚发生技术已较成熟。在胚乳培养方面,已能够诱导出愈伤组织、胚状体或已经能够分化出根,但只有10多种木本观赏植物获得了胚乳植株,如中华猕猴桃(Actinidia chinensis)、罗田甜柿(Diospyros kaki‘Luotian-tianshi’)等。能够成功进行原生质体分离培养的树种达40多种,其中桑树(Morus alba)、苹果(Malus pumlia)、毛白杨(Populus tomentosa)、白榆(Ulmus pumila)、二球悬铃木(Platanus hispanica)等10多种树木已通过这种途径建立了再生体系。

应用组织培养技术建立植物再生体系,能够极大地促进木本观赏植物品种改良和分子育种的发展。选择合适的再生途径对建立木本观赏植物再生体系十分重要,根据再生过程经历的途径不同,木本观赏植物的离体再生途径大致可分为顶芽或腋芽途径、不定芽途径、胚状体途径、原球茎途径。顶芽或腋芽途径是木本植物组培快繁应用最广泛的方法,珙桐(Davidia involucrata)、银杏(Ginkgo biloba)、胡桃(Juglans regia)、云南山茶(Camellia reticulata)、桑树等很多木本观赏植物都成功使用了该方法;在不定芽途径中常用的外植体有茎尖、茎段(鳞茎、块茎、匍匐茎)、花芽、叶、叶柄、根、花茎、萼片、花瓣、花托等,在木本观赏植物中,报道使用这种方式繁殖成功的也较多,如翅果油树(Elaeagnus mollis)、杜仲(Eucommia ulmoides)等;使用胚状体途径试验成功过的有苏铁(Cycas revoluta)等;目前,原球茎途径正处于试验研究阶段,尚未见使用这种方式成功快繁木本植物的报道。

在木本观赏植物再生体系建立过程中,使用顶芽或腋芽途径的多数经过3个阶段即可完成植株再生,依次为愈伤组织的启动、增殖与生根阶段,如广玉兰(Magnolia grandiflora)、麻竹(Dendrocalamus latiflorus)等;有些需经过4个阶段,即启动、增殖、壮苗、生根,如变叶木(Codiaeum variegatum)、合欢(Albizia julibrissin)等;少数将启动培养和增殖培养合二为一经过2个阶段即可完成,如腊梅(Chimonanthus praecox)等。使用不定芽途径或胚状体途径的一般经过4个阶段培养完成植株再生,如华北落叶松(Larix princilis-ruppiechtii)等;也有经过3个阶段的,即将愈伤组织的诱导与分化合为一步,如雪柳(Fontanesia fortunei)等。各步骤之间无严格固定的界限,具体分法要根据具体要求和条件来确定。

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2 影响木本观赏植物组织培养的主要因子

建立一个木本观赏植物快繁体系需要考虑的因素有很多,其中主要涉及合适的快繁途径、外植体类型、基本培养基类型、激素和其他添加物的种类和配比、环境条件的控制等,近几年的研究也主要围绕在这方面。

2.1 外植体 外植体类型是木本观赏植物组织培养的重要影响因子之一。从理论上来说,植物的各个器官和组织均可用于组织培养,但大量研究表明,树木的不同组织或部位及其所处的发育阶段或生理状态在器官发生能力上有相当大的差别。采集外植体时应根据组培目标和快繁途径以及所用植物的生态习性选择合适的外植体类型,一般选择幼嫩的器官或组织,如茎尖、幼叶、胚、子叶、下胚轴等,也有适合用茎段、成熟叶片、根、髓、花器官等作为外植体的。

对芽和茎段进行诱导愈伤试验,发现在相同培养条件下,芽为外植体产生愈伤组织的时间早,诱导率高,且愈伤组织生长速度快;苹果组培研究表明,以叶片作外植体时,以新梢顶端将展开幼叶的植株再生能力强,叶片的中部比顶部或基部更易于再生植株,叶片近柄端愈伤组织发生较早;李慧等在银白杨(Populus alba)叶片不定芽再生影响因素的研究中发现诱导出芽时间和再生率自上而下依次递减。

2.2 培养基 组织培养中,植物材料附着在培养基上并且从中吸收所需要的各种物质,不同的培养基对有目的的组织培养非常重要。大多数植物组织培养所用的培养基中均含有无机营养物质、碳源、有机添加物、植物生长调节剂和胶凝剂。

不同类型植物或者外植体适宜的培养基不同。研究表明,在B5培养基上,茎段愈伤组织诱导率高于叶片,而在MS培养基上,叶片愈伤组织诱导率高于茎段。培养阶段或者培养目标不同,合适的培养基也不同,一般认为较低的无机盐浓度、高生长素浓度和低细胞分裂素浓度利于生根,如毛叶枣(Zizyphus mauritiana)在启动和增殖阶段使用MS培养基生长较好,但生根阶段却以1/2 MS培养基为宜;诱导银杏茎段愈伤组织适宜的培养基为MS,分化芽的最适培养基为1/2 MS,而诱导根却在White培养基上。竹子在离体快繁的过程中更易见到试管苗开花,这实际上是由于营养供应不全或不足时营养生长不正常而转向生殖生长,从而出现花芽分化导致开花。此外培养基的存在状态也能影响组培效果,如使用液体培养基更能促进山茶花生根等。

2.3 激素 在植物组织培养中,外源激素的种类、质量浓度和配比是主要的因素之一。一般使用的激素有生长素类、细胞分裂素、赤霉素类、脱落酸、乙烯、油菜素甾体类物质等。

木本观赏植物组培中常用的细胞分裂素类物质有6-BA(6-苄基腺嘌呤)、KT(激动素)、ZT(玉米素)、TDZ(噻重氮苯基脲)等。细胞分裂素对组培中不定芽的分化及增殖有着显著的作用,其中6-BA使用广泛,使用浓度范围大多在0.05~3.00 mg/L,但也有例外,如野生荔枝(Litchi chinensis var.euspontanea)的种子萌发培养基中6-BA的浓度达到了20 mg/L。有些细胞分裂素对愈伤组织的形成也有明显作用,如KT和6-BA,两者的作用各有特点,6-BA能促进细胞分裂,有利于愈伤组织的形态建成;KT对愈伤组织诱导率的影响不大,但在诱导培养基中添加适量的KT可改善愈伤组织的质量。还有研究表明,对诱导不定芽发生,TDZ在某些树种中表现出了特别的效果,如0.002~0.050 mg/L的TDZ可诱导花楸、刺槐(Robinia pseudoacacia)等植物形成大量的芽,诱导能力是6-BA的50~100倍。

木本观赏植物组培中常用的生长素是2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)、NAA(萘乙酸)、IAA(吲哚乙酸)、IBA(吲哚丁酸)等。在诱导愈伤组织和诱导生根的时候往往以生长素为主,大多数植物都能在添加2,4-D的培养基上诱导出愈伤组织,但2,4-D有抑制芽形成的副作用,而且过量使用会产生毒害作用,因此在愈伤组织诱导阶段,添加外源生长素类时应优先考虑采用NAA、IAA,如两者都不能完成愈伤组织诱导时,再考虑采用2,4-D诱导。已有试验证明,适宜浓度的NAA可以替代2,4-D。在诱导愈伤组织时,一般还需要添加一定量的细胞分裂素,这样可使获得的愈伤组织更具有胚性。

大量研究表明,在培养过程中,有时候使用单一某种激素即有效果,使用芽作为外植体时,发现培养基中添加适宜浓度的2,4-D和NAA即可使愈伤组织诱导率高达100%,说明当外植体细胞分裂能力较强时,只使用细胞生长素也可诱导愈伤组织。但很多时候使用某一种激素的同时,添加少量其他激素可取得更好的效果,利用茎段作外植体,在B5培养基中添加NAA(3.0 mg/L)和6-BA(0.1 mg/L),使愈伤组织诱导率达100%。也有些植物要使用2种或以上的激素才能够起作用,如在含有BA的培养基中,柠条(Caragana korshinkii)要通过加入2,4-D才能形成愈伤组织,而花棒((Hedysarum scoparium)、羊柴(H.leave)需要再加入IAA来诱导形成愈伤组织。

一般认为,培养基中生长素和细胞分裂素的比值高时,有利于根的分化或愈伤组织的形成,比值低时,则利于芽的分化。但也有例外,如紫杉(Taxus cuspidata)茎尖能诱导出不定芽与不定根,但不定芽的形成与6-BA/IBA比值和母树树龄有关,而不定根的形成主要取决于IBA的质量浓度与母树树龄。

2.4 其他添加物 木本观赏植物组织培养中,还经常需要加入其他的有机物等外源添加物,如椰子乳、天冬酰胺、谷氨酰胺、CH(水解酪蛋白)和 GA3(赤霉素)、AgNO3、PP333(多效唑)、活性炭、间苯三酚、核黄素、氯化胆碱、青霉素等。例如,在进行壮苗培养时加入赤霉素可以促进茎的伸长;在培养基中添加活性炭能够提高生根苗的质量。

2.5 环境条件 光照、温度、培养时间、继代次数等环境因素也能明显的影响组培效果。采用赤桉(Eucalyptus camaldulensi)叶片诱导不定芽时,先暗培养10 d后再转移到16 h/d的光暗交替培养条件下,其不定芽的诱导率要高于全程光下培养的诱导率,但随着暗培养时间的延长,不定芽诱导率会下降;苹果进行生根培养时往往需要先在根原基诱导培养基中黑暗条件下培养5~7 d,根原基产生后再转入不定根伸长培养基中培养;研究了日平均温度20℃下的3个不同温差,即+10℃(光期25℃,暗期15℃)、0℃(光期20℃,暗期20℃)、-10℃(光期15℃,暗期25℃)变温处理对组培苗的作用效果,结果表明苗体高度随温差的增大而增大,但苗的干重和鲜重不受温差影响;很多植物在多次继代后变异几率可能会增加,而有些植物却能长期继代,如月季等在多次继代后仍能长期继代,且可保持原来的再生能力和增殖率;在柠檬桉的生根培养阶段,需要继代培养几次后才能发根;月季等在移栽前需要在生根培养基上培养一段时间(无论生根与否),然后再移栽更易成活。

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3 木本观赏植物组织培养中常见的问题及处理

褐化、污染、玻璃化是木本观赏植物组织培养再生体系建立过程中常见的问题。

3.1 褐化 木本植物体细胞内含有较多的酚类化合物,当细胞膜的结构发生变化和破坏时,这些物质相互接触发生一系列酶促反应,形成有毒害的褐色物质,外植体随之进一步变褐死亡,这种现象称为褐化。同时,发生褐化的组织也会向培养基内释放褐色物质,以至危害到周围的材料。在培养基中加入Vc可有效的防止褐化;蛋白水解产物、多胺等物质也可作为抑制剂来防止褐变的发生。此外,选择合适的消毒剂和消毒方法,适当低温,适当降低培养基的pH,适当降低培养基中无机盐的浓度,降低接种密度,缩短转瓶周期等也可减轻褐化的发生和危害。还有不少研究表明光照也能影响褐化,但在不同植物种类中表现出的规律不同,甚至相反。同时还要注意,一些因素具有多重影响,如活性炭也能有防止褐化,但活性炭也能吸附培养基中的一些其他有机物,所以在加入活性炭的培养基中应适当调整激素配比使其维持在适宜的水平。

3.2 污染 对于外植体本身带菌,可针对外植体的选取和消毒2方面处理。对母株进行预处理,采集外植体时尽量选取带菌少的材料。给外植体消毒的时候,一般使用酒精和升汞结合的消毒方法,还有一些比较特殊的方法,如减压灭菌法、臭氧消毒法、间隙消毒法、超声波振动灭菌等,另外,用多菌灵和青霉素的混合液处理污染程度较轻的月季(Rosa chinensis)带芽茎段也能获得较好效果;冲洗外植体时或消毒时加入少量表面活性剂可提高去污和消毒杀菌效率;在培养基中加入适量抗生素等抗菌剂也有一定效果,但长期使用可能会出现耐药性。在实际操作中,往往综合使用多种方法来达到效果。

在进行接种操作时和培养过程中,为防止带入微生物引起污染,需及时更换切割外植体时使用的无菌盘,使用2套镊子和手术刀以提高工作效率和减少交叉污染的几率;在首次培养时,若不清楚污染率大小,则宜选用小容器、多数量、尽量分散、相互隔离的培养方法,以减少可能的损失,也便于统计污染率。

3.3 玻璃化 玻璃化(Vitrificatiion),又称超水化(Hyperhydration),是指在培养过程中材料呈半透明状、组织结构发育畸形的现象。发生玻璃化的材料分化能力降低,极易引起植株死亡,且不易移栽成活。玻璃化的成因较复杂,目前研究较多的是培养基水势、细胞分裂素和碳源的状况。一般情况下,适当增加琼脂浓度,降低培养基的衬质势,适当通气以降低培养容器内的相对空气湿度和乙烯含量,同时改善氧气和CO2的供应状况,适当降低培养基中NH4+浓度,并提高培养基中的Ca2+浓度,适当增加自然光照等均可减轻玻璃化的发生几率。此外不少研究表明,细胞分裂素和生长素的配合以及激素和K+之间的配合也能影响玻璃化的发生,但具体原因尚不清楚。

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近些年来,木本观赏植物组织培养技术已在微繁殖、植物脱毒、培育新品种、生产次生代谢产物、种质资源保存以及生命科学研究等方面取得了较大的理论研究进展和一定的社会效益,但仍然存在一些问题,如研究范围较窄、不够系统化、技术不够稳定成熟,经常会遇到畸形苗、褐化、玻璃化和污染等问题。因此,今后应扩大研究范围,增加科研投入,加强基础性研究的深入和理论体系的构建,注重组培研究和生产的市场化运作等,让这项技术更好的服务于科学发展和生产实践。

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